Proteinas

EXPLORACIÓN DEL METABOLISMO DE LAS PROTEÍNAS

Celso Cruz Rodríguez

RESUMEN

Con razón se ha dicho que las proteínas constituyen el pilar fundamental en el laboratorio bioquímico que todos los seres vivos tienen en su interior. Las enzimas y muchas hormonas, entre otras sustancias, son proteínas que rigen los procesos vitales en el organismo de los seres humanos y de los animales. La diversidad proteica es considerable, al igual que las posibilidades para la cuantificación de estos compuestos que contienen nitrógeno, carbono y oxígeno. En este capítulo se expone un grupo de métodos que se utilizan para la determinación de las proteínas en material biológico y se trata acerca de otros avances importantes como la sustitución de los métodos cinéticos (actividad total de la enzima) por los que miden la masa molecular (por medio de reacciones antígeno-anticuerpo), más sensibles y específicos. También se hace referencia a los reactantes de la fase aguda y al valor de la proteína C reactiva como factor de riesgo de la enfermedad cardíaca coronaria.

INTRODUCCIÓN

Las proteínas se sintetizan en el interior de las células, pasan al líquido intersticial y, de allí, se vierten en el plasma y demás líquidos corporales. La cantidad, tipo y secuencia de los aminoácidos de las cadenas polipeptídicas que las constituyen, les proporcionan su forma característica e influyen, de manera decisiva, en sus funciones biológicas.

ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS

La estructura primaria de las proteínas está constituida por el tipo y secuencia aminoacídica. La secuencia depende solo de los enlaces covalentes (peptídicos)

y es predeterminada por el código del ADN.

La secundaria está formada por la disposición en espiral de la cadena polipeptídica de la estructura primaria, en una dimensión. Esta estructura, en muchas proteínas globulares, presenta dilataciones, plegamientos y enrollados, debidos a muchos enlaces de hidrógeno y, de manera ocasional, a enlaces covalentes disulfuro.

La terciaria es la estructura constituida por el plegamiento intramolecular de la cadena polipeptídica para formar una estructura tridimensional compacta de forma específica y que se mantiene por los enlaces electro-valentes, los enlaces hidrógeno, los puentes disulfuro, las fuerzas de Van der Waals y las interacciones hidrofóbicas. Estas últimas son consideradas la fuerza mayor en la conservación de la estructura terciaria, la cual le confiere a las proteínas sus propiedades biológicas específicas.

La estructura cuaternaria está representada por la asociación de varias cadenas polipeptídicas que forman una gran unidad de agregados oligoméricos. Esta estructura se consolida con el estrecho ajuste de las unidades polipeptídicas a través de contactos de su superficie con los grupos prostéticos. La albúmina, por ejemplo, carece de estructura cuaternaria, pues posee solo una cadena polipeptídica. Sin embargo, la enzima creatin-quinasa,

constituida por dos cadenas polipeptídicas, tiene tres isoformas enzimáticas mayores, que dan lugar, en ella, a varias estructuras cuaternarias.

PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS

Las propiedades físico-químicas de  las proteínas se utilizan como base para su identificación, separación y cuantificación. Ellas constituyen los principios o fundamentos de los métodos para su estudio.

Las proteínas pueden ser separadas, desde el punto de vista físico, de acuerdo con su tamaño. Su masa molecular relativa permite la separación de las moléculas grandes o pequeñas mediante la diálisis o la filtración en gel. La densidad de muchas proteínas es de aproximadamente 1,33 con excepción de las lipoproteínas, en las cuales oscila entre 1,006 y 1,21, lo cual permite la separación de estas por medio de la ultra-centrifugación.

La solubilidad, otra propiedad de las proteínas, está dada por la afinidad que tienen por diferentes solventes.

Si esta se pierde, al modificarse las propiedades físico-químicas del solvente (pH, fuerza iónica, constante dieléctrica, temperatura) por medio de experimentos, se produce la precipitación de las proteínas al estado de insolubilidad. Lo mismo ocurre cuando las proteínas son desnaturalizadas por la acción de agentes físicos como el calor o por distintas sustancias como la

urea, el dodecilsulfato de sodio, y ácidos y bases débiles, lo que produce la destrucción de sus estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria.

Hasta hace pocos años fue muy utilizado el método conocido como precipitación salina (salting out) para separar proteínas. La caída de la constante dieléctrica del solvente, producida por la adición de sales o solventes

orgánicos, da origen a la separación y precipitación de las proteínas.

Los análisis cuantitativos del contenido proteico en la orina y en el líquido cefalorraquídeo (LCR), se basan, por lo general, en los siguientes principios:

1. Reacción de los enlaces polipeptídicos con iones de cobre en solución alcalina (reacción Biuret) o de los residuos de tirosina y triptófano de los aminoácidos en soluciones fenoladas (método de Lowry).

2. Absorción ultravioleta (UV) en los intervalos de 200 a 255 nm y de 270 a 290 nm.

3. La precipitación y posterior cuantificación con métodos turbidimétricos o nefelométricos.

4. La unión a colorantes indicadores como: azul brillante Coomassie, rojo Ponceau S, bromocresol verde y bromocresol púrpura.

OTROS PRINCIPIOS Y TÉCNICAS PARA LA SEPARACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

Además de los referidos antes, existen otros principios y técnicas para la separación y cuantificación de las proteínas. Algunos, descritos hace varias décadas, se mantienen vigentes hoy día y otros forman parte de los procederes nuevos que han surgido al amparo de nuevas tecnologías introducidas en años recientes. A continuación se exponen algunos.

 

ELECTROFORESIS

El principio de la electroforesis se basa en que las partículas cargadas, en este caso las proteínas, ubicadas en un campo eléctrico, migran hacia uno de los

electrodos del campo, en dependencia de:

1. La carga eléctrica de la partícula.

2. El tamaño de la partícula.

3. La fuerza del campo eléctrico.

4. Las características del medio utilizado como soporte durante el proceso de la migración.

Las partículas cargadas negativamente (aniones) se dirigen al ánodo (electrodo positivo), y las cargadas positivamente (cationes) se dirigen al cátodo (electro-do negativo). Si se hace variar el pH de la solución amortiguadora, en la cual están disueltas las proteínas, estas migrarán en el campo eléctrico creado, y se se-pararán unas de otras, al migrar cada una de ellas distancias diferentes. Esta migración se produce sobre un soporte que puede estar constituido por soluciones coloidales, geles (agar, almidón, agarosa, acrilamida) o papel (de filtro o acetato de celulosa). En el caso de la electroforesis en papel de acetato de celulosa, una vez separadas las fracciones, son coloreadas y luego cuantificadas.

Para ello se utiliza la técnica densitométrica, descrita en otra sección de este libro. El gráfico que se obtiene, conocido como electroforegrama o patrón electroforético, lo componen (cuando se utiliza el papel como soporte), en un orden de izquierda a derecha, las fracciones siguientes:

1. Albúmina.

2. Alfa 1 globulinas.

3. Alfa 2 globulinas.

4. Betaglobulinas.

5. Gammaglobulinas.

Los espacios que ocupan estas fracciones, se conocen como zonas del electroforegrama y reciben el nombre de la fracción correspondiente.

La correcta interpretación del patrón electroforético requiere del conocimiento de la semiología de cada una de las fracciones que lo constituyen.

La albúmina es la principal proteína producida por el hígado y representa más de la mitad del contenido proteico total del suero. Es la proteína más homogénea, la más soluble y la más estable de las que se encuentran en el plasma.

Sus funciones más importantes las realiza manteniendo la presión osmótica, transportando una gran variedad de sustancias, y como fuente endógena para el suministro de aminoácidos. Puede ser metabolizada por cualquier órgano del cuerpo humano.

El aumento en la concentración sérica de la albúmina se produce, por lo general, durante la deshidratación (aumento relativo), la administración intravenosa de concentrados de esta proteína o por error en su de-terminación

en el laboratorio. Los trastornos más frecuentes que tienen relación con este componente, se corresponden con su disminución, conocida como hipoalbuminemia y que se acompaña casi siempre del signo clínico del edema.

La hipoalbuminemia aparece en numerosas enfermedades, asociada con otros signos clínicos (tabla 2.1).

Tabla 2.1 Causas de la hipoalbuminemia

Enfermedades	Causas de la hipoalbuminemia
Enfermedad hepática	Disminución en la síntesis por: Enfermedad hepática intrínseca Alcoholismo Desnutrición
Enfermedad renal	Aumento de las pérdidas por: Rápida degradación Aumento de la presión oncótica en suero (uremia) Desnutrición
Enfermedad gastrointestinal	Aumento de las pérdidas por: Obstrucción hepática Malabsorción Desnutrición
Enfermedad pulmonar	Aumento de las pérdidas por: Expectoración Daño hepático Aumento en la producción de globulina y reactantes de la fase aguda
Quemaduras	Aumento de las pérdidas por: Exudación intensa Recirculación anormal Daño hístico extenso

Los métodos utilizados para su cuantificación son los siguientes:

1. Electroforéticos.

2. Inmunoquímicos: electroinmunodifusión, inmunodifusión radial, turbidimétricos y nefelométricos.

3. Unión a colorantes indicadores: bromocresol verde y bromocresol púrpura.

En la zona de las alfaglobulinas migra un conjunto de proteínas que se conocen como alfa 1 globulinas y alfa 2 globulinas. Las alfa 1 globulinas están representadas por las siguientes:

1. Alfa 1 antitripsina: proteína inhibidora de la tripsina y la plasmita, cuya función es proteger al organismo de la autodigestión. Forma parte del grupo de los reactantes de la fase aguda. Aumenta en las enfermedades inflamatorias y disminuye en la deficiencia congénita de esta proteína, enfermedad cuyo cuadro clínico se caracteriza por presentar enfisema pulmonar asociado con insuficiencia hepática.

2. Alfa 1 glicoproteína ácida: es un reactante de la fase aguda.

3. Alfa 1 lipoproteína: transportadora de lípidos, vita-minas

liposolubles y hormonas.

4. Globulina unida a la tiroxina.

5. Alfa 1 fetoproteína: sintetizada por el hígado embrionario.

Su determinación constituye una prueba diagnóstica para los defectos del tubo neural y es un marcador tumoral para el carcinoma de células embrionarias del testículo, teratocarcinomas, cáncer gástrico, pulmonar y hepatocelular.

En el grupo de las alfa 2 globulinas se incluyen las siguientes:

1. Alfa 2 macroglobulina: es una inhibidora de la plasmina y la tripsina.

2. Alfa 2 lipoproteína: transportadora de lípidos, en especial, triglicéridos.

3. Haptoglobina: reactante de la fase aguda y además transportadora de la hemoglobina libre en plasma.

El estudio de sus niveles se utiliza cuando hay hemólisis en las reacciones ostransfusionales. En los pacientes que han sufrido reacciones postransfu-sionales, disminuye la concentración de haptoglobina al agotarse la capacidad del hígado para sintetizarla, ante la demanda excesiva por la cantidad de hemoglobina que debe transportar.

4. Ceruloplasmina: proteína transportadora del cobre.

5. Colinesterasa: proteína que hidroliza la acetilcolina.

Las betaglobulinas agrupan a las siguientes:

1. Betalipoproteína: transportadora de lípidos.

2. Transferrina: proteína transportadora del hierro en suero. También se une de manera reversible a otros cationes como cobre, cinc, cobalto y calcio. Los

niveles plasmáticos son regulados por la disponibilidad de hierro. Como se sintetiza en el hígado, sus valores pueden disminuir en enfermedades hepáticas agudas como las hepatitis y en las crónicas, en la desnutrición y enteropatías con pérdida de proteínas.

Sus niveles plasmáticos varían en la anemia por déficit de hierro, lo cual causa un incremento en su síntesis. Por el contrario, si la anemia se debe a una falla en la incorporación del hierro a los eritrocitos, sus niveles son normales o bajos. En la sobrecarga de hierro, sus valores son normales, pero la saturación es muy alta.

3. Plasminógeno: proteína encargada de la lisis de la fibrina.

4. Complemento: constituido por un grupo de proteínas que intervienen en la propiedad fagocítica de la sangre.

5. Fibrinógeno: factor proteico de la coagulación de la sangre.

Las gammaglobulinas agrupan a las llamadas inmunoglobulinas, constituidas por cinco fracciones diferentes:

G, A, M, D y E.

Todas tienen funciones de anticuerpos contra virus, bacterias y parásitos. En las enfermedades autoinmunes se comportan como autoanticuerpos al actuar contra células del organismo al cual pertenecen.

INMUNOELECTROFORESIS

La inmunoelectroforesis combina el poder de separación de la electroforesis con la capacidad resolutiva de la inmunoprecipitación, basada en la especificidad inmunológica.

Después de realizar la electroforesis a las muestras de suero, se depositan en pocillos individuales, un suero polivalente (antinmunoglobulinas total) y sueros mono-valentes (anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti kappa y anti lambda). El antígeno y el antisuero difunden el uno hacia el otro, y se produce una banda de precipitina cuando alcanzan la zona de equivalencia.

La inmunoelectroforesis tiene su indicación precisa cuando se aprecian anormalidades en el estudio electroforético realizado antes.

El patrón electroforético normal es de fácil interpretación.

Lo mismo ocurre cuando adopta características especiales que identifican a un buen grupo de enfermedades (figuras 2.5 y 2.6).

Un ejemplo de ello se observa cuando en la zona de las alfaglobulinas, de las betaglobulinas o de las gamma-globulinas, zonas que por lo general no tienen picos, aparece un pico proteico, de base estrecha, que señala la presencia de una proteína monoclonal. La inmunoelectroforesis mantiene su vigencia diagnóstica, al igual que la electroforesis y la cuantificación de las inmunoglobulinas, cuando un patrón con estas características está presente.

Las células productoras de inmunoglobulinas (células plasmáticas y linfocitos) tienen una función muy especializada.

Cada una de ellas, agrupadas en clones, produce la misma clase y tipo de inmunoglobulina. La proliferación de estas células, conocidas como inmunocitos, puede ocurrir en varios grupos de ellas, que dan lugar a varias clases y tipos de inmunoglobulinas. En este caso, se dice que la afectación es policlonal (varios clones) y su expresión en el patrón electroforético se caracteriza por un pico proteico no pronunciado, con una base ancha. Si la proliferación ocurre de forma aislada en un grupo celular que produce una clase y tipo de inmunoglobulina, la afectación es monoclonal (un clon) y su expresión en el patrón electroforético se caracteriza por un pico proteico muy pronunciado, con base estrecha, en la zona de las alfaglobulinas, betaglobulinas o gammaglobulinas (figura 2.6, esquemas VII, VIII, IX y X).

La respuesta de los inmunocitos en las enfermedades infecciosas e inflamatorias crónicas es siempre policlonal. En el caso opuesto, cuando la respuesta es monoclonal, en el 45 % de los pacientes constituye un signo de malignidad y se relaciona con enfermedades como mieloma múltiple, amiloidosis, enfermedades linfoproliferativas, plasmocitoma solitario y macroglo-bulinemia.

INMUNOFIJACIÓN ELECTROFORÉTICA

La inmunofijación electroforética ofrece una elevada resolución, por lo que facilita la identificación de proteínas monoclonales en cantidades mínimas. Se basa en la combinación de la electroforesis seguida por la inmunoprecipitación. Las tiras de acetato de celulosa se saturan con antisuero monoespecífico y se aplican a proteínas séricas, antes separadas por electroforesis, en sus respectivas zonas de migración. Durante la incubación, los complejos inmunes formados pueden ser identificados como bandas diferentes. Aunque este método es muy sensible, tiene algunas desventajas, como son: el elevado costo de los antisueros monoespecíficos y la gran cantidad que de ellos se necesita para empapar las tiras de acetato.

TURBIDIMETRÍA

La turbidimetría es uno de los dos métodos que involucra la interacción de la luz con partículas en solución.

Estas disminuyen la trasmisión de la luz debido a la reflexión, dispersión y absorción del rayo luminoso.

Es un método sensible y sigue la ley de Beer en un amplio rango de concentraciones.

NEFELOMETRÍA

La nefelometría es una técnica similar a la turbidimetría y se utiliza cuando las partículas en solución son pequeñas y en escasa concentración. Se emplea con frecuencia para medir la dispersión de la luz, que ocurre como resultado de la reacción antígeno-anticuerpo, lo que permite su cuantificación. Entre sus ventajas se encuentran las siguientes: rapidez, reactivos simples y posibilidades de automatización. Es una metodología simple y precisa. Sus principios se exponen en otra sección de este libro.

INMUNODIFUSIÓN RADIAL

La inmunodifusión radial es un método para cuantificar proteínas mediante una reacción con difusión única en una dimensión.

Los sueros de referencia (calibradores), controladores y muestras, se colocan en pocitos ponchados en gel de agarosa que contiene el antisuero monoespecífico.

El antígeno presente en la muestra difunde de forma radial a través del gel y forma un anillo de precipitación, al unirse al anticuerpo presente en el antisuero monoespecífico (reacción antígeno-anticuerpo).

El diámetro de los anillos se mide, y se calculan los valores. Antes de disponerse de la nefelometría, este método fue muy utilizado para la cuantificación de las inmunoglobulinas.

RADIOINMUNOENSAYO Y ENSAYO INMUNORRADIOMÉTRICO

El principio en que se basan las técnicas de radioin-munoensayo (RIA) y de ensayo inmunorradiométrico (IRMA) es el mismo para ambas. En las dos se utiliza un antígeno marcado con un isótopo (el más frecuente es el 125 I). El antígeno marcado compite por los sitios de unión en el anticuerpo. En este sistema, la avidez del anticuerpo por el antígeno marcado y el no marcado, debería ser igual. Para conocer la cantidad de proteína (antígeno) presente, se obtiene la cuantificación del antígeno marcado, al separar el anticuerpo que está unido al antígeno marcado del antígeno marcado libre.

Esta separación puede lograrse por 3 vías:

1. Absorción del antígeno libre marcado.

2. Precipitación de los antígenos marcado y no marcado unidos al anticuerpo.

3. Uso de anticuerpos de fase sólida para atraer los anticuerpos unidos al antígeno marcado y no marcado.

La inmunorradiometría, a diferencia del RIA, utiliza, en lugar de antígenos, anticuerpos marcados con isótopos. En este tipo de ensayo, el ligando en las muestras compite con el ligando unido a una superficie sólida (tubos o perlas de vidrio recubiertas) por los sitios de unión del anticuerpo marcado. Hay entonces una competencia entre el ligando unido a una superficie sólida y el ligando de la muestra con el anticuerpo marcado. La cantidad de anticuerpo marcado unido a la superficie sólida, es detectada después que el exceso del anticuerpo marcado y la muestra se han eliminado. De nuevo hay una relación

inversa entre la cantidad de radiactividad detectada en el tubo y la concentración del ligando en la muestra desconocida.

 

ENSAYOS INMUNOENZIMÁTICOS

Los ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) son métodos muy útiles para la cuantificación de proteínas y se utilizan mucho en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, endocrinas y autoinmunes. Estos requieren de la separación del complejo antígeno-anticuerpo.

Las variantes más comunes son:

1. Método indirecto para la detección de anticuerpos.

2. Método de doble anticuerpo (sándwich) para la detección de antígenos.

Las características del ensayo inmunoenzimático han sido estudiadas en otra sección de este libro. Este método ha desplazado bastante al RIA, al dejar a un

lado las implicaciones que tiene trabajar con material radiactivo. En cuanto a la sensibilidad, el ELISA es similar al RIA, aunque su especificidad es discretamente menor. Los reactivos son estables y las lecturas se pueden realizar en un espectrofotómetro común.

Mención aparte merece la electroquimioluminiscencia, principio que ha invadido el mercado internacional al incorporarse a una gran variedad de equipos automáticos que han simplificado, de forma drástica, los análisis de hormonas, marcadores tumorales, marcadores para anemias, infarto de miocardio y dosificaciones de medicamentos en san-gre.

La electroquimioluminiscencia ocurre con numerosas moléculas como rutenio, osmio y renio. Con el uso del rutenio quelado, como complejo para el desarrollo de luz, se ha hecho posible la determinación de aminoácidos, haptenos y ácidos nucleicos. Este método ha sido descrito en otra sección de este libro (véase el capítulo sobre inmunoquímica).

REACTANTES DE LA FASE AGUDA

Casi todas las proteínas plasmáticas se sintetizan en el hígado, con la excepción de las inmunoglobulinas y las hormonas proteicas. Son múltiples las enfermedades en las cuales se alteran la cantidad y las proporciones de estas proteínas en los líquidos corporales, como ocurre, por ejemplo, en las reacciones inflamatorias que aparecen durante la evolución del infarto del miocardio (IMA), infecciones, tumores, y después de intervenciones quirúrgicas. Las proteínas plasmáticas que sufren alteraciones durante la inflamación, se conocen como reactantes de la fase aguda (RFA). Se supone que este grupo proteico juega un importante papel en el complejo proceso de la inflamación (cuadro 2.1).

Cuadro 2.1 Causas de la elevación de los reactantes de la fase aguda

Enfermedades inflamatorias Enfermedades malignas Traumatismos Posoperatorio Enfermedades autoinmunes

Los niveles plasmáticos de los RFA se elevan en tiempos diferentes. En primer lugar lo hacen la proteína C reactiva (PCR) y la alfa 1 antitripsina; 12 horas después, se elevan la alfa 1 glicoproteína ácida, la haptoglobina, la fracción C4 del complemento y el fibrinógeno. Las últimas en elevarse son la ceruloplasmina y la fracción C3 del complemento. Todas alcanzan su máxima concentración entre 2 y 5 días. Los cambios en su concentración, que responden a un aumento en la síntesis por parte del hígado, no permiten conocer ni la ubicación ni las causas de la reacción inflamatoria, pero constituyen una excelente herramienta para controlar, desde el punto de vista evolutivo, su progreso o desaparición y, por lo tanto, la eficacia o no del tratamiento impuesto (tabla 2.2).

Tabla 2.2 Respuesta de los reactantes de la fase aguda ante el proceso inflamatorio

Reactantes	Elevación de los resultados
	Comienzo(h)	Pico máximo (h)
Proteína C reactiva	2	48
Alfa 1 antitripsina	8	72 - 120
Alfa 1 glucoproteína ácida	8	72 - 120
Haptoglobina	8	72 - 120
C3 y C4	8	72 - 120
Fibrinógeno	8	72 - 120

El aumento de la síntesis de las proteínas de la fase aguda, se acompaña de la disminución de la prealbúmina, de la albúmina y de la transferrina, que constituyen los llamados reactantes de la fase negativa.

Por lo general, las proteínas de la fase aguda forman parte del grupo de las alfa 1 globulinas y alfa 2 globulinas.

Estas, a su vez, constituyen la llamada zona de las alfa en el diagrama electroforético.

El fibrinógeno, proteína de la fase aguda, influye en la determinación de la velocidad de sedimentación eritrocitaria (VSG). En las enfermedades hepáticas crónicas, la concentración del fibrinógeno disminuye, y su efecto acelerador sobre la VSG queda a cargo de la albúmina, que disminuye, y de las globulinas, que aumentan.

LAS ALFAGLOBULINAS Y LAS BETAGLOBULINAS EN LA VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN ERITROCITARIA

La albúmina es estabilizadora de la VSG. En las infecciones agudas, la albúmina plasmática disminuye y las alfaglobulinas y el fibrinógeno aumentan, combinación que acelera la VSG y que constituye la causa principal de esta aceleración en afecciones como la nefrosis y la cirrosis.

En el mieloma múltiple, la VSG se acelera de manera considerable. La formación de pilas de monedas, originadas por la sedimentación rápida de los eritrocitos, impide muchas veces que se extienda, de forma adecuada, la sangre periférica sobre el portaobjetos. Aunque el cuadro proteico plasmático es muy variable en esta enfermedad, por lo general hay una gran concentración proteica en la zona de las globulinas (pico monoclonal, paraproteína) y una discreta disminución de la albúmina. Estas alteraciones proteicas en el plasma delos pacientes, causan la aceleración de la VSG por encima de 100 mm/h.

En la VSG, la sedimentación de los eritrocitos transita por 3 fases (A, B, C):

A: fase inicial, de pocos minutos, durante la cual se forman las pilas de monedas.

B: fase que tiene una duración de 30 minutos a 2 horas, que depende de la longitud de la pipeta y en el transcurso de la cual la sedimentación ocurre a una velocidad constante.

C: fase lenta, en la que se produce el empaquetamiento de la columna de eritrocitos.

La fase B es la más importante. La VSG debe “montarse” preferiblemente antes de transcurrir 2 horas de tomada la muestra. En determinadas circuns-tancias, este período puede prolongarse hasta 6 horas, pero no más, pues se invalidan sus resultados.

La VSG se determina con métodos manuales y automáticos. Entre los métodos manuales, el más utilizado es el de Westergreen en cualquiera de sus modificaciones.

Para el uso en pediatría, existen las microtécnicas.

CARACTERÍSTICAS DE LAS PROTEÍNAS COMPRENDIDAS EN EL GRUPO DE LOS REACTANTES DE LA FASE AGUDA

Proteína C reactiva (PCR). Esta proteína fue identificada en 1930, en el suero de pacientes con neumonía causada por neumococos y se comprobó que

podía unirse al polisacárido C del Streptococcus pneumoniae, y producir floculación. Luego, se detectó su presencia en otras enfermedades inflamatorias agudas.

La PCR fue el primer reactante de la fase aguda que se identificó. Es sintetizada por el hígado y se vierte en el plasma. Un subgrupo de los linfocitos también la produce en pequeñas cantidades, pero en este caso permanece unida a la superficie celular. Su elevación en el plasma se produce a las 2 horas, y alcanza su máxima concentración a las 48 horas. Esta proteína constituye el marcador de la inflamación por excelencia y tiene numerosas funciones como: dar comienzo a la opsonización, a la fagocitosis y a la activación del complemento, de los neutrófilos y de los monocitos macrófagos. Estas propiedades le permiten jugar un importante papel en el reconocimiento

de organismos microbianos y como inmunomodulador en el huésped. También es importante para el reconocimiento de los tejidos necrosados. Durante muchos años fue poco utilizada, a pesar de conocerse su importancia como marcador inflamatorio. A comienzos de la década de los 90 del siglo XX, se prestó atención una vez más a sus posibilidades de diagnóstico y aparecieron publicaciones más completas, que volvieron a situarla entre las determinaciones más utilizadas en el laboratorio clínico. Un hecho importante en su revalorización, lo fue la comparación de esta prueba con otra, muy utilizada desde hace años como marcador no específico de la actividad de los procesos patológicos: la VSG.

La PCR tiene algunas ventajas en relación con la VSG. Entre ellas sobresale el hecho de que el fibrinógeno, las proteínas monoclonales y la morfología eritrocitaria, no son causas de interferencia. Al igual que la VSG, cuando la PCR es positiva, indica la existencia de un proceso inflamatorio, pero no ofrece datos sobre sus causas.

En relación con los métodos para la determinación de la PCR, también existen ventajas si los comparamos con la VSG.

La VSG, cuando se determina con métodos manuales, requiere de pipetas especiales, de una observación estricta de la relación anticoagulante-sangre, de la colocación de la pipeta cargada en un soporte en posición vertical y del reposo durante 1 hora. Cualquier variación en las condiciones antes señaladas, causa errores groseros en los resultados. Para la VSG existen métodos automáticos que se reservan para los laboratorios que tienen una carga grande de trabajo, que justifique la adquisición de un equipo tan costoso para

realizar ese tipo de análisis.

En su determinación, la PCR ofrece las ventajas siguientes:

1. Prueba de aglutinación con látex, de fácil realización.

2. Ensayos inmunoenzimáticos manuales o automáticos (ELISA), nefelometría con láser, fluorescencia polarizada e inmunoturbidimetría. Ya sea el método manual o el automático, el tiempo consumido en su determinación no es mayor que 10 minutos y el material biológico es, por lo general, suero.

Aunque todavía la VSG se mantiene como una prueba de uso generalizado, tiene en la PCR una potente rival que ha ganado territorios diagnósticos en enfermedades como apendicitis, pancreatitis, enfermedades reumáticas (artritis reumatoidea) y cardiovasculares.

En este grupo de enfermedades y en los trastornos vasculares periféricos, la PCR es considerada un factor de riesgo. A partir de estudios publicados en 1997, se demostró la importancia de la PCR como agente predictivo de futuros IMA, o de la posible repetición del IMA cuando, después de ocurrido el primer ataque, sus valores se mantienen elevados.

Alfa 1 antitripsina. Es un inhibidor de la tripsina y la plasmina, por lo cual protege al cuerpo de la autodigestión. Se eleva en las reacciones de la fase aguda y en el embarazo. Su deficiencia es causa de enfisema pulmonar y falla hepática en la enfermedad homocigótica.

Alfa 1 glucoproteína ácida. Su función es des-conocida.

Su determinación se utiliza para seguir las reacciones de la fase aguda.

Haptoglobina. Se une a la hemoglobina libre en el suero. Se determina para el seguimiento de las reacciones de la fase aguda y en los procesos en los que ocurre hemólisis, como las reacciones postransfusionales y anemias hemolíticas, en las cuales su concentración disminuye al unirse a la hemoglobina libre que proviene de los eritrocitos destruidos.

C3 y C4. Los niveles del complemento aumentan en las reacciones inflamatorias (fase aguda). Sus valores disminuyen en las enfermedades autoinmunes.

Fibrinógeno. Es un factor de la coagulación de la sangre. Además, forma parte de los RFA, por lo que aumenta en las infecciones, en las reacciones inflamatorias y en el embarazo. Disminuye en los trastornos de la coagulación como la coagulación intravascular diseminada (CID), en las enfermedades de origen congénito y adquirido (hepatopatías).